فایل بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب FGFR2b و تغییرات ساختاری آن بر اثر برهمکنش با فلزات سمی

توضیحات

فایل بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب FGFR2b و تغییرات ساختاری آن بر اثر برهمکنش با فلزات سمی
این پایان نامه در قالب فرمت word قابل ویرایش ، آماده پرینت و ارائه به عنوان پروژه پایانی میباشد.
زمينه: عوامل رشد فیبروبلاست (FGF) و گیرنده های آنها (FGFR) نقش اساسی در سلول ایفا می کنند. عدم تنظیم در مسیرهای سیگنالینگ FGF / FGFR با بسیاری از ناهنجاری ها و گسترش سرطان همراه است. از این گروه گيرنده‏ فاکتور رشد فيبروبلاستي نوع دو در مسير پيام‏رساني سلولي و تنظيم فرآيندهاي مهم زيستي از جمله تمايز و تکثير سلولي نقش اساسي دارد. اختلال در انتقال پیام این گیرنده با چندین اختلال پاتولوژیکی انسانی مرتبط می باشد. در این میان مسمومیت با فلزات سمی نیز یکی از مشکلات عمده در زیست شناسی سلولی است که اثرات آنها بر مسیرهای مختلف سیگنالینگ به اثبات رسیده است.
هدف: این مطالعه به منظور تخلیص ناحیه کینازی FGFR2b و بررسی اثر فلزات سمی سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم بر ساختار ناحیه کینازی رسپتور فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع دو انجام شد.
مواد و روش‏ها: در این مطالعه تجربی پروتئین نوترکیب با استفاده از پلاسميدpLEICS-01 ، باکتري BL21، القائ IPTG ، الکتروفورز و ستون حاوي Ni2+ -NTA بیان و خالص شد. فعال بودن نمونه پروتئين بعد از دياليز توسط تعامل با ناحيه SH2 فسفوليپاز(PLC)C طبيعي و موتان توسط روش PAGE بررسي شد. طیف فلوئورسانس، CD, FTIR و دناتوراسیون شیمیایی پروتئين خالص شده در حضور غلظت های مختلف سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم بررسی و ارزیابی گردید.
يافته‏ها: بررسي SDS-PAGE قبل و بعد از القا شدن نشان داد که پروتئين بيان شده در دماي 20 درجه سانتي گراد محلول است. نتايج PAGE فعال بودن پروتئين خالص شده را تأیید کرد. بررسی طیف سنجی فلوئورسانس کاهش شدت نشر را با افزایش تدریجی غلظت هر چهار فلز سمی نشان داد. طیف CD نشان داد ناحیه ی کینازی مورد مطالعه ما دارای ترکیب بتای بیشتری نسبت به آلفا می باشد و نیز حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم در محلول، ساختار دوم کیناز را تغییر نمی دهد، ولی سرب قادر به تغییر این ساختار می باشد. آزمایش انجام شده توسط FTIR نیز اثر سرب را تایید کرد. دناتوراسیون شیمیایی ساختار سوم در حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم ناحیه کینازی را تغییر نداد. ولی این تغییر در حضور سرب مشاهده شد.
بحث و نتيجه‏گيري: باتوجه به یافته ها، ناحيه‏ کينازي گيرنده‏ نوترکيب عامل رشد فيبروبلاستي 2b که يک پروتئين 38 کيلودالتوني است توليد و خالص گرديد و نشان داده شد که به صورت محلول و فعال است. تغییرات ساختار سوم و دوم ناحیه کینازی موجب ناپایدار شدن آن در حضور سرب گردید. این ناپایداری در سطح مولکولی می تواند موجب اختلال در مسیر پیام رسانی سلول شود. گرچه این ناپایداری در حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم مشاهده نشد.
-1- مقدمه
1-1-1- فاکتور رشد فيبروبلاستي
فاکتور رشد فيبروبلاستي يا FGF (شکل 1) پروتئيني است که در بسياري از فرآيندهاي سلولي نظير تقسيم سلولي، تکوين جنين، رگ زايي و بسياري از فرآيندهاي ديگر نقش دارد. به علاوه، اين پروتئين به عنوان يك فاكتور مهم به محيط کشت سلولهاي بنيادي جنيني انساني اضافه مي شود تا بتوان سلول ها را در حالت بنيادينگي و بدون تمايز حفظ و تکثير کرد (1).
1-1-2- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست
گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست(FGFR) در مسیر پیام رسانی سلول نقش کلیدی درتنظیم فرآیندهای زیستی از جمله تکثیر سلولی، بقا، مهاجرت و تمایز سلولی ایفا می کنند (2). متابولیسم سلولی، ترمیم بافتی، رگ زایی و توسعه ی مراحل جنینی از جمله وظایفی هستند که در دوران جنینی و بزرگسالی در بدن توسط این گیرنده ها با اتصال به فاکتورهای رشد فیبروبلاستی (FGF) انجام می شود(3). فرم های موتاسیون یافته ی گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی در سرطان های متعددی از جمله سرطان ریه، پستان، معده، مغز، سر و گردن، پروستات، کولون، رحم، مثانه و هم چنین مولتیپل میلوما شناخته شده است(6-4). عدم تعادل در انتقال پیام (سیگنالینک) FGFR با چندین اختلال پاتولوژیک انسانی مانند سندرم های اسکلتی مرتبط است (4). در این میان، FGFR2، نقش مهمی را در رشد و ترمیم بافتی بویژه استخوان و عروق خونی دارد.